专论与综述中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集磺酰脲类除草剂微生物降解研究进展李伟波，柏连阳，黄灿(1．湖南农业大学生物安全学院，湖南长沙；2．湖南省望城县农业局，湖南望城)摘要：介绍了磺酰脲类除草剂的降解方式；综述了磺酰脲类除草剂微生物降解研究进展，包括分解磺酰脲类除草剂的微生物种类和分解机理，磺酰脲类除草剂的残留分析检测方法以及目前降解微生物的筛选方法．提出了研究存在的问题，预测了发展趋势．关键词：微生物降解；磺酰脲除草剂；残留检测Wei-bo·-(1．ege ity，，China；2．，，China)： the ，．， ．re．；：nisms： 1 前言磺酰脲类除草剂由美国杜邦公司于20世纪70年代研究成功，80年代大量开发应用，是一种 高效、广谱、低毒、高选择性的除草剂，它的问世标志着除草剂进入超高效时代。
该类除草剂 占近年来开发的新农药中约30％，是目前世界上使用量最大的一类除草剂，占除草剂使用量的 50％60％。我国目前应用的该类除草剂品种主要有苄嘧磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆、吡嘧磺隆、 甲磺隆、苯磺隆、醚磺隆、氯嘧磺隆等十几个品种，其中氯磺隆的应用面积最大，约占播种面 积的6％，其次是甲磺隆，占播种面积4％。然而，由于目前开发的磺酰脲类除草剂残留期都比较 长，极易对后茬作物造成药害，连年使用更甚，给农业生产带来了巨大的损失。因而，有关磺 酰脲类除草剂的降解特别是微生物降解的研究对于治理磺酰脲类除草剂污染、扩大该除草剂的 使用范围、促进农业的发展具有重要意义。磺酰脲类除草剂的微生物降解与该除草剂的其他的降解方式联系比较密切，因而，了解磺 酰脲类除草剂的其他降解方式有助于深入研究磺酰脲类除草剂的微生物降解。 2磺酰脲类除草剂的降解许多研究表明：磺酰脲类除草剂的降解方式包括光解，水解和生物降解。其中，以水解和 生物降解为主要方面。 2．1光解司友斌等研究表明：光能够促进苄嘧磺隆降解，通过对苄嘧磺隆在土壤中光解产物进行分 离和鉴定，得出主要光解产物的分子结构，并由此推测出其光解历程。一是苄嘧磺隆分子的脲 ·86· 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集专论与综述 桥发生断裂，二是苄嘧磺隆分子上S02NH键断裂，三是苄嘧磺隆分子脲桥基的缩并。
磺酰脲类 除草剂的光解符合一级动力学方程。绿磺隆的光解较慢，有机色素对光降解有猝灭效应。但是， 由于磺酰脲类除草剂大多数是土壤处理剂，容易受到土壤的吸附和植株的荫蔽，光照效率低， 因而光解只对暴露在土表的一小部分药剂起作用，对磺酰脲类除草剂的降解不起主要作用。 2．2水解磺酰脲类除草剂的化学水解是羰基碳上的亲核取代反应。由于磺酰基的强吸电子效应增加了 羰基的极性，水分子更易进攻极化的羰基碳而发生脲桥断裂的水解反应，最终形成无除草活性的 酸性，电离后产生的负离子降低了羰基的极性，亲核试剂的进攻减弱，水解反应难以进行．但在 酸性条件下，H可与羰基的氧结合形成铮盐，然后重排成碳正离子，水解反应更为容易。所以， 在酸性条件下，磺酰脲类除草剂易于分解，而碱性条件下稳定。等发现，氯磺隆和 甲磺隆在酸性条件下分两步水解，首先是磺酰脲桥裂解，氯磺隆产生4．甲氧基．6．甲基．1，3，5．三嗪 ．2胺和邻氯苯磺酰氨基甲酸，甲磺隆产生邻甲氧羰基苯磺酰氨基甲酸；第二步是氨基甲酸水解， 分别产生邻氯苯磺酰胺和邻磺酰胺基苯甲酸甲酯；噻磺隆的酸性水解机理是磺酰脲桥的裂解和三 嗪环上的甲氧基脱甲基作用同时发生，随后三嗪环进一步裂解，有研究表明三嗪环主要靠微生物 降解。
2．3生物降解生物降解包括低等原生动物、植物的代谢作用和微生物降解。有些不敏感的植物在体内多种 酶的作用下，通过脱氯、羟基化、脱酯、缩合或者共轭作用将其分解或者钝化，例如玉米和小麦 能够在数小时内将大豆地除草剂氯吡嘧磺隆降解为无除草活性的物质。水稻能够将苄嘧磺隆代谢 为对ALS完全没有涪I生的4．羟基嘧啶衍生物，小麦能够催化氯磺隆苯环5号位碳原子羟基化，羟 基化的衍生物再与UDP-葡萄糖转化酶的作用下与葡萄糖轭合而失去活性。通过微生物，尤其是土壤中存在的微生物降解是磺酰脲类除草剂降解的主要方式。 3磺酰脲类除草剂的微生物降解 迫下，微生物通过变异作用，能够降解这些物质，这对于环境的净化具有极其重要的意义。由此 基于微生物降解有毒害物质的生物修复()技术得到了发展。磺酰脲除草剂作为一类难降解的顽固性化合物，尽管应用历史比较短，但很多研究证明微生 物对该类除草剂的降解起主要作用。微生物不仅可以直接降解母体化合物，还可以通过分解水解 的产物来促进水解反应，同时能够显著降低土壤中结合态磺酰脲类除草剂含量。Joshi等发现，氯 磺隆在环氧乙烷或丫一射线消毒后的土壤中降解速率显著降低，Mill等应用土壤微宇宙系统在灭 菌和非灭菌条件下监测两个月来研究14C．氟嘧磺隆的降解，结果表明，在同样深度的灭菌土壤中， 氟嘧磺隆的降解要比不灭菌土壤中的半衰期长3倍以上，而且深度土壤中的残留量和灭菌土壤中 的没有差异，证明微生物是降解氟嘧磺隆的主要方式。
甲基一嘧磺隆()在土 下的水解，随后微生物对其水解产物进行作用。氯磺隆在非灭菌的土壤中lld内有95％被降解。 相比，降解速率更快。 3．1 降解磺酰脲类除草剂微生物的筛选的方法地球上的微生物大部分生活在水体、土壤中，种类繁多。如何才能得到能够降解目标化合物 的微生物，这一过程包括采样、富集培养、分离获得3个过程。’ 3．1．1采样包括采集水样和土样，一般在生产该类除草剂的工厂附近的排污口或者消化池中采样，连年·87。 专论与综述中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 使用该类除草剂的农田也可以采样。 3．1．2富集培养富集培养()或选择培养()，就是利用微生物性状上的差异， 给与某些生长条件，从而增殖该条件下而生长的微生物。目前的富集培养主要采用瓶培养法或者 成为液体富集培养法()，土壤环流法()以及连续流动培养 法()。目前筛选磺酰脲类除草剂所用的富集培养条件主要是在微生物 的富集培养基中加入一定浓度的该类除草剂溶液，通过选择压力的作用，使能够适应生长的微生 物增殖，而不能适应的微生物逐渐减少。
瓶培养法主要是在封闭的系统内对微生物进行驯化，但是系统内部的条件改变时，例如：营 养耗尽时，要求取出一定菌样，继续转入到符合富集培养条件的瓶中培养，而且逐渐加大所要降 解的目标化合物的量，使微生物逐渐适应这种高浓度化合物条件，并能够利用这些化合物进行自 身代谢。土壤环流法主要是防止微生物在封闭系统内部环境过度改变，从而在封闭系统内部造成 一个与土壤环境包括营养条件、气体液体和固体三相的条件团粒结构等相类似的环境，尽可能多 得到微生物种类。连续培养则完全是在一个开放的体系中进行，培养液不断流出，而新的培养液 不断流入体系，保持体系内的环境条件趋于稳定。 3．1．3分离纯化微生物富集培养后，必须对其进行分离和纯化，得到单纯的微生物种类，一般采用平板稀释 培养法。只有获得了纯培养的微生物，才能够更好地研究微生物的降解机制。 3．2 降解磺酰脲类除草剂的微生物种类能够降解磺酰脲类除草剂的微生物有细菌、真菌等，放线菌。邵劲松等研究表明黄单胞菌属me,／L，30C培养40h后，降解 ()的一个种能够降解氯磺隆。在氯磺隆起始浓度为20 磺隆的半衰期由自然条件下的50d缩短为18d，降解速度也比自然条件的快2．5倍，降解效果比较 明显。
沈东升等通过甲磺隆驯化的土壤中分离到细菌4株，真菌9株和放线菌20株，降解效率比6 较高的有青霉属的一个种(置力，降解效率达到O．071ed(g·h)，放线菌中的一个菌株降 解效率达-至tJo．0356趴g·”。汪海珍等研究表明优选菌株()和有机肥的同时加 入能较明显缩短土壤中甲磺隆的降解半衰期，并显著缓减了结合态甲磺隆残留物的形成，促进了 结合态甲磺隆残留物向可提取态残留物转化或矿化形成C02，李军红等通过对污水处理厂的活性 污泥中细菌驯化30d后获得较高的降解氯磺隆的活性。 3．3微生物降解机理微生物对农药的作用方式可分为两大类，～类是微生物直接作用于农药，通过酶促反应降解 农药，常说的农药微生物降解多属于此类；另一类是通过微生物的活动改变了化学和物理的环境 而间接作用于农药。常见的作用方式有矿化作用、生物浓缩或累积作用和微生物对农药的间接作 用。微生物通过酶促反应降解农药的方式主要有氧化、脱氢、还原、水解、合成等几种反应类型。微生物对农药的降解利用主要有3种方式：①微生物直接以农药作为生长基质，在分解代谢 该有机物的过程中获取生命活动所需的能量及本身物质更新所需的原料；②共代谢：指微生物 在有其可利用的碳源存在时，对其原来不能利用的物质也可分解代谢的现象。
共代谢反应中产生 的既能代谢转化生长基质又能代谢转化目标污染物的非专一性酶，是微生物共代谢反应的关键， 研究表明，这一类型的酶是在底物诱导的条件下产生的。许多研究证实，在没有底物驯化 ()的条件下，微生物并不具有对该底物的降解作用；③种间协同代谢：指同一环境中 的几种微生物联合代谢某种农药。研究表明，细菌对农药具有降解作用的酶有许多是由细菌所含有的质粒编码合成的，但目 前有关控制降解解磺酰脲类除草剂的质粒研究报道很少。而真菌里，有关降解磺酰脲类除草剂的 酶的分离纯化有报道，纯化后的酶比微生物的降解效率更高。 · 88· 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集专论与综述 3．4与微生物降解有关的环境条件适宜于微生物生长的条件，都有利于促进磺酰脲类除草剂的降解，与之有关的环境条件包括 温度、pH值、水分、药剂本身性质等。相对而言，我国北方，气温低，土壤含水量少且呈碱性， 许多微生物的快速生长和大量繁殖受到一定限制，同时，这些条件不利于磺酰脲类除草剂的化学 降解，因而该类除草剂在北方残留期要长于我国南方。药剂本身的性质包括药剂的水溶性，药剂 浓度、分子结构和在土壤中吸附性等方面，农药发生降解的一个必要条件是微生物或者酶系与农 药接触，因而水溶性大的分子有利于微生物的分解。
微生物通过改变周围的环境条件而促进磺酰脲类除草剂的报道不多，从理论上而言，微生 物如果能够改变环境的pH条件，特别是降低pH值，就能够促进磺酰脲类除草剂的分解。同时， 微生物大量繁殖，形成菌丝体或大量菌体构成的菌团，具有比较大的表面积，菌丝体或者菌团是 否对磺酰脲除草剂分子具有吸附、富集的效应的报道也比较少。 4磺酰脲类除草剂的残留分析在研究微生物对磺酰脲类除草剂的降解作用时，磺酰脲类除草剂的残留检测分析是一个重要 的方面，贯穿于微生物的筛选、微生物的降解效率测定、微生物的降解机理等过程。目前，测定 磺酰脲类除草剂残留主要有高效液相色谱法(HPLC)和生物测定法。其他的方法还包括气相色谱 法(GC)、液质联用法(LC／MS)、酶联免疫法、毛细管电泳、极谱法等方法。生物测定法主要是利用敏感生物对于药剂的反应程度来衡量药剂的浓度。通过测定生物在一 定剂量范围内的生物发育量和剂量的关系，制作标准曲线或者回归方程，从而求得待测样品的残 留量。它对于测定生物活性很高，残留量很低，用一般化学方法难以分析的磺酰脲类除草剂的残 留量，比较合适。具有灵敏度高、方法简便、费用小的优点。常用的指示作物有玉米、大豆、水 稻、高粱、油菜等。
蔡立用玉米根抑制法测定土壤中绿磺隆的生物测定方法，其重现性好，变异 系数符合我国农药残留分析的有关质量管理标准，敏感性好，检测限达到10刁g／l(g。并用 衅1．00)。高效液相色谱法是目前检测磺酰脲类除草剂残留最经典的方法，分析速度快，灵敏度高，回 收率高，检测限低。该法对待测样品前处理主要采用固相萃取技术(SPE)，回收率可达65％～ 85％，针对该法回收率偏低的缺点，又采用了液．液提取(LLE)法，此法目前在我国应用比较多。 近年来又发展了固液膜提取法(sLM)、超临界流体萃取等技术(SLE)。检测器多采用紫外检 测器或光导检测器，溶剂多为甲醇、乙腈、蒸馏水等。等建立了采用高效液相色谱和可变 紫外检测器检测环境中9种磺酰脲类除草剂(四唑嘧磺隆、绿嘧磺隆、绿磺隆、胺苯磺隆、o．7 为10。6～1g／kg，回收率在70％120％之间，相对标准偏差小于20％。高效液相色谱测定的缺点在于仪器要求高、费用高，提纯样品需要繁琐程序以保证达到样品 检测极限，同时不能够检测到结合状态的残留。生物测定法专～性差，且基本为半定量检测法。 近几十年快速发展的酶连免疫吸附法(ELISA)因其快速、灵敏，有替代其他测定方法的趋势。
其原理在于利用动物对外界刺激物质能够产生特定抗体，可以从动物的血清中提取抗体作为固定 相反应物。等采用此法测定了绿磺隆的残留，用重氮化合物用共价键与蛋白质结合作物 免疫原灵敏度达到0．4岭／I嘻。 5存在的问题及展望综合近几年国内外有关磺酰脲类除草剂降解的研究，笔者发现，目前对于磺酰脲类除草剂在 环境中的物理及化学行为是研究的热点，而对于微生物降解研究的不够充分，具体在以下几方面。 5．1微生物种类筛选不够全面·89· 专论与综述中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集目前有关降解磺酰脲类除草剂的研究多集中在真菌这类微生物，筛选出来的多为真菌，而细 菌、放线菌以及厌氧微生物降解磺酰脲类除草剂的研究不多，微生物资源筛选不够，利用不充分， 微生物种间协同降解的研究也很少有研究报道。 5．2研究还处于比较粗浅的阶段目前的研究还停留在筛选菌株或者提取菌株细胞内酶的阶段。降解研究均是在实验条件下的 液体纯培养进行，与田间使用存在较大差距。微生物降解该类化合物的机理研究不深入，代谢历 程也没有完整的研究和报道。而微生物降解有机磷农药的研究已经达到了分子生物学的水平，有 关降解酶以及降解质粒，基因工程菌株的构建初见端倪。
然而，相对于有机磷农药的应用而言，磺酰脲类除草剂应用历史不太长。随着除草剂开发难 度的加大，杂草抗性加剧，磺酰脲类除草剂应用范围将会扩大，因而，在不久的将来，对于降解 该类除草剂微生物的筛选将会更深入。同时，由于分子生物学的飞速发展，其他的检测技术的提 高，有助于了解微生物降解该类除草剂的机理及代谢途径，从而进一步研究降解菌的诱变，通过 基因工程技术构建多功能高效降解新菌株，同时利用微生物降解菌酶制剂和固定化酶反应器技术 为低成本利用微生物消除农药污染提供有效的手段。 参考文献(略) ·90·